Antraknoya na jagodi

Antraknoza jagode – Colletotrichum acutatum

PATOGEN : Colletotrichum acutatum

ANAMORF : Glomerella acutata

SINONIMI : Colletotrichum xanthii Halsted
Antracnose black spot ( na jagodi ) , Terminal crook disease ( na boru ) , Leaf curl ( na celeru ) , Crown rot ( na celeru ) / English /
Taches noires du fraisier / Franch /
Manchas negros del freson / Spanish /

SISTEMATIKA : Gljiva – Ascomycetes – Polystigmatales ( anamorf )

DOMAĆINI : Napada širok krug biljaka , ali je posebno opasan patogen u kulturi jagode ( Fragaria ananassa ).

Ostali domaćini su : Anemonae coranaria , Apium graveolens , Pinus eliottii , Pinus rodiata , Capsicum annum , Licopersicon esculentum , Malus domestica , Olea europea , Solanum melongena , Vaccinum spp. , Lupinus arborens …

GEOGRAFSKA

RASPROSTRNJENOST :

EPPO region -Belgija , Francuska , Nemačka , Italija , Španija , Holandija
Azija -Hong Kong , Indija , Indonezija , Izrael , Korejska Republika ,Mala Azija , Šri Lanka , Tajland
Afrika -Etiopija , Kenija , Nigerija , Tanzanija , Zimbabve
S. Amerika -SAD , Kanada
C. Amerika i Karibi -Kosta Rika i Dominikanska Republika
J. Amerika -Brazil , Kolumbija , Ekvador
Okeanija -Australija i Novi Zeland

SIMPTOMI :
– pegavost lista
– pege po lisnim ,cvetnim drškama i stolonama
– propadanje cvetnih pupoljaka
– ubrzano propadanje biljaka
– propadanje plodova

Nepravilne pege na listu ( Irregular leaf spot )

Braon do crne lezije, često suve obrazuju se duž ivice lista i na vrhu liske. Lezije se obrazuju od ivice ka vrhu lista i dostižu veličinu 3-18 mm i nepravilnog su oblika. Spore počinju da se obrazuju tek kada je list u potpunosti razvijen, ali zaražen list može da stoji na vrhu biljke i 2-3 meseca. Gljiva sporuliše duž lezija. Inficirani delovi biljke u letnjim mesecima predstavljaju izvor inokuluma za antraknozno uginjavanje cvetnih pupoljaka i plodova.

Antraknozna plamenjača cvetova ( Anthracnose flower blight )

Cvetovi, cvetni pupoljci, cvetne drške i stablo mnogih sorti jagode su osetljivi na antraknozu. Naročito su osetljive cvetne drške. Infekcija može da se ostvari u bilo koje vreme od momenta izlazaka pupoljaka ali su potpuno otvoreni cvetovi najosetljiviji.
Zaraženi cvet brzo truli i otpada, formira se tamna lezija koja se širi duž cvetne drške do nekoliko mm ispod čašice. Cvetna drška može biti inficirana pred otvaranje cvetnih pupoljaka kada se formira lezija neposredno ispod cvetne čašice obuhvatajući cvetnu dršku i uništava cvetni pupoljak.
Ukoliko do infekcije dolazi kada je cvetni pupoljak formiran tada ona kreće od čašičnih listića koji se suše, dobijaju braon boju a kao rezultat toga je inhibicija cvetanja.
Kada se infekcija cvetova javlja neposredno pred oprašivanje, tamno braon lezije liče na one koje može da prouzrokuje Rhizoktonia pritom se šire ka vrhu ploda. Suvi plodovi i povređeni delovi se ne razvijaju, a površina im je obilno prekrivena sporonusnom masom.
Pri toplim i vlažnim uslovima tokom cvetanja svi noseći delovi cveta mogu da uginu i biljke dobijaju « spržen « izgled.

Propadanje pupoljaka ( Bud rot )

Gljiva može da uništi pupoljke biljaka u zasadu za nekoliko dana u rasadnicima koji se nalaze u fazi pred plodonošenje ili je prošlo nekoliko nedelja od formiranja pupoljaka na biljkama. Proces truljenja se nastavlja dok zaraženi delovi dobijaju braon – crvenu do crnu boju.
Biljke koje imaju samo jedan pupoljak propadaju, dok kod biljaka sa većim brojem pupoljaka trulež može da se razvije samo na jednom pupoljku koji kasnije otpada, a ostali pupoljci nastavljaju svoj razvoj.
Bolest može da zahvati čitavu biljku kada ona vene i propada. Na zaraženim pupoljcima se vidi masa roze konidija. Kada su inficirani pupoljak i cvetni venac sa uzdužnom lezijom, vidi se jasna linije razgraničenja između braon zaraženog tkiva na pupoljku i zdravog tkiva na vencu. Čak i kada biljka ugine ne dolazi do pojave braon-crvene boje na vencu kao što je to slučaj kada je biljka inficirana sa Colletotrichum fragariae.

Propadanje krune ( Crown rot )
Prvi simptom krunične infekcije je venjenje zaražene biljke tokom perioda nedostatka vlage ( što se dešava kasnije u letnjim mesecima ). Mlada 2 ili 3 lista na inficiranoj biljci venu tokom dana dok se tokom noći regenerišu.
Krunična infekcija se u rasadnicima često širi ali se dešava da se teško uočava u vreme plodonošenja. Micelija gljive se dalje razvija u biljci i ona kasnije može da ugine usled toplog vremena tokomjeseni ili sledećeg proleća. Kada su povoljni uslovi za razvoj bolesti propadanje krune se lako širi sa biljke ne biljku i za nekoliko dana može da zarazi ceo zasad koji vene i uginjava.

Kada se krunica uvele biljke iseče uzdužno uočava se crveno-braon izumrlo tkivo. Oštećenje krunice obično počinje sa jedne strane blizu osnove lisne drške i šire se kroz krunicu horizontalno u obliku latiničnog slova V.
Patogen može da se izoluje sa sveže uvelih biljaka tako što se uzima parčence sa mesta prelaza zdravog u obolelo tkivo i zasejava na krompirov-dekstrozni agar.

Antraknozno truljenje plodova ( Anthracnose fruit rot )

Simptomi se manifestuju kao svetlo braon, vodene, ugnute pege koje mogu da pređu u tamno braon ili crnu boju. Pri vlažnim uslovima u centru lezija se obrazuju roze, roze-narandžaste spore. Lezije se šire i infekcija zahvata ceo plod. Napadnuti zeleni plodovi postaju crni i lako otpadaju. Često se na inficiranim delovima biljke obrazuje masa konidija.
C.acutatum stvara prave, cilindrične konidiospore oštrih krajeva, veličine 8,5-16,5 x 2,4-4 µm. U acervulama se stvaraju roze, roze-narandžaste ili narandžaste konidiospore. Acervule sa bodljama se stvaraju na biljci domaćinu kao i na hranjivim podlogama, izuzetak je jagodin lisni agar. Tamo dolazi do stvarnja tamno braon neseptirane micelije debelih zidova.

CIKLUS RAZVIĆA :

Glavni izvor zaraze na početku sezone je zaražen sadni materijal.
C.fragariae koji se održi u zemljištu naredne sezone ima uži izbor biljaka domaćina. C.acutatum i C.gleosporoides imaju širi krug domaćina.
Zaražen sadni materijal i zemlja su prvi izvor inokuluma. Kod višegodišnjih biljaka gljiva prezimi u inficiranim biljkama i biljnim ostacima i na taj način se obezbeđuje inokulum za sledeću vegetaciju.
Konidiospore koje se obilno proizvode na delovima biljaka ( stolone, rozete, lisne drške, plodovi ) šire se putem kišnih kapi, oruđem, …
Bolesti najviše pogoduje toplo i vlažno vreme, dok je širenje bolesti po suvom i hladnom vremenu minimalno.

EPIDEMIOLOGIJA :

Stvaranje i klijanje spora na zaraženim plodovima jagode je najbolje pri vlažnom i toplom vremenu. Optimalna temperatura za infekciju biljaka je 20°C. Za klijanje spora je neophodna vlažnost vazduha od oko 100%. Proizvedene konidiospore se šire vodom, vetrom i insektima.
C.acutatum može da se održi u zemlji ili u zaraženim biljnim ostacima više od 9 meseci. Spore se uništavaju ukoliko se zemljište tretira metil-hlor pikrinom. Ovaj patogen ima period inkubacije u trajanju od 3 dana u vlažnim uslovima.
Otvoreni cvetovi, polu-zreli i zreli plodovi su jednako osetljivi na ovog patogena kao i zeleni plodovi i zatvoreni pupoljci.

METODE ZA DIJAGNOSTIKU I IDENTIFIKACIJU :

– Vizuelni pregled svakog dela biljke, postavljanje u vlažnu komoru na 22°C za iniciranje obrazovanja sporonosnih organa, pripremanje mikroskopskih preparata od obrazovanih micelija u lezijama.
– Izolacija na hranjive podloge : krompirov dekstrozni agar i jagodin lisni agar ( parčence sa granice zdravog i obolelog tkiva inkubirati na hranjivoj podlozi u termostatu da bi se obrazovali sporonosni organi i spore patogena ). Pravi se mikroskopski preparat za posmatranje ( izmeri se 100 spora i očita se srednja vrednost u µm ).
– Parakvat test je drugi brz metod za izolaciju : lisne drške jagode se tretiraju rastvorom parakvata za stimulaciju sporonošenja gljive. Pravi se mikroskopski preparat i vrši se posmatranje.
– Serološke metode : ELISA
– Molekularne metode : PCR

Stimulacija sporulacije u cilju detekcije : Mirujući oblik patogena koji se nalazi u slabo vidljivim lezijama na peteljkama i izdancima biljke ne može biti detektovan vizuelnim pregledom. U tom slučaju neophodna je posebna procedura za njegovu detekciju :
1. detekcija amplifikacijom gljive ( klopke, stimulacija sporulacije, zasejavanje na semi selektivne podloge )
2. identifikacija morfologijom, ELISA, PCR. Različite metode detekcije uključuju izolaciju na selektivne podloge, klopke na plodove paradajza i jabuke, stimulisanje sporulacije parakvat testom i test sa monoklonalnim antitelima treba izvršiti i uporediti.

Tretman rastvorom parakvata uzrokuje da patogen sporuliše na peteljkama biljke gde se acervule mogu i vizuelno potvrditi. Patogen može biti prisutan na svakom delu biljke ali ga najviše ima u osnovama starih peteljki. Za potrebe testiranja uzorkovati peteljke sa starijeg lišća. Uzorkovanje izvršiti sa najmanje 300 reprezentativnih biljaka ( dodatak – 1 ).

Za detekciju C.acutatum prave se mikroskopski preparati. Oblik i veličina konidija su jedinstvene za ovog patogena ali se mogu pomešati sa konidijama G.cingulata. Potvrda prisustva C.acutatum radi se dalje serološkom metodom – ELISA. Ukoliko se na ovaj način dobiju granični rezultati, treba izolovati čistu kulturu gljive ( dodatak – 3 ). Njegova morfologija treba biti determinisana u laboratorijskim uslovima ( dodatak – 4 ) i ELISA test treba da se ponovi. Ako su dobijeni rezultati i dalje na granici treba izvršiti testiranje PCR-om ( dodatak – 5 ). Za ELISA i PCR koristiti suspenzije iz čistih kultura C.acutatum.

NAČIN PRENOŠENJA :

– Micelija obolelog rasada
– Zaražena zemlja
– Zemlja iz zasada
– Zaraženi plodovi
– Drugi zaraženi delovi biljaka

FITOSANITARNE MERE :

– Zdrav sadni materijal
– Prostorna izolacija u matičnjacima
– Borba sa patogenom u zasadima
– Balansirano azotno đubrenje
– Blagovremeno otkrivanje i uništavanje obolelih biljaka i plodova

Dodatak – 1

Procedura za parakvat test

Koriste se peteljke od 300 uzoraka jagode. Ako je materjal za testiranje cela biljka, odbaciti većenu zdravog lišća sa svakog uzorka ; sačuvati osnovu od 2 cm i odbaciti listiće. Dobro isprati osnovu peteljki nekoliko puta tekućom vodom da bi se odstranili svi tragovi peska i zemlje. Peteljke sterilisati 4 minuta u 1l razređene NaOCl . Ispiranje izvršiti 2x u tekućoj vodi.
Nakvasiti peteljke sa 1l rastvora parakvata . Isprati 1x sa 1l tekuće vode. Raširiti peteljke u jednom sloju u vlažnoj komori.
Vršiti inkubaciju pod konstantnim osvetljenjem na 25ºC u trajanju od 6 dana. Izvršiti posmatranje peteljki pod stereo mikroskopom da bi se videle acervule , karastične konidije i konidiospore C. acutatum.

Dodatak – 2

PROCEDURA ZA SEROLOŠKU IDENTIFIKACIJU C. ACUTATUM
IZ ČISTE KULTIRE ILI ZAREŽENIH PETELJKI

Pripremanje uzoraka

Od kultura C.acutatam-a pravi se čista kultura na PDA podlozi. Za formiranje čiste kulture je potrebno 6 dana. Iz nje se uzima 1 cm2 konidija i smešta u zatvorenu tubu sa 1 ml koating pufera. Vrši se mućkanje na vorteksu 10 s.
Pojedinačne peteljke, koje su tretirane parakvatom i inkubirane 6 dana ( dodatak – 1 ), smeštaju se u tube od 10 ml u koje je dodat 1 ml koating pufera. Mućkanje se vrši na vorteksu minimum 10 s kako bi se osiguralo pranje svih peteljki.
Drugu grupu peteljki, posle parakvat testa, izdeliti na manje delove i svaki deo smestiti u plastične kese zajedno sa 10 ml koating pufera. Izvršiti maceraciju uzoraka.
Za plodove – postaviti pojedinačne plodove sa simptomima u kutiji. Koristeći pipetu isprati svaki plod sa 0.5 ml koating pufera.
Navedenom procedurom tretirati potvrđeno zdravo i bolesno tkivo biljaka kako bi smo napravili pozitivnu i negativnu kontrolu. One se do upotrebe skladište na – 20 ºC. Kontrole se mogu nabaviti i od Adgen Diagnostic System ( GB ).

ELISA procedura

Pipetom sipati po 100 µl pozitivne i negativne kontrole u po dva bunarčeta ELISA ploče. Preostale bunarčiće napuniti uzorcima ( 1 uzorak u 2 bunarčića ). Ukoliko ima praznih bunarčića njih napuniti koating puferom. Ploča se pokrije parafilmom ili folijom i inkubira 1 h na 33 ºC ili preko noći na 4 ºC.
Izbaciti uzorke iz ELISA ploče 10 % belilom ( sredstvo za dezinfekciju ). Ploče zatim isprati puferom za ispiranje koji sadrži Tween 20 ( PBSt ) ( 0.137 m NaCl, 0.003 m HCl, 0.021 m Na2PO4, 0.015 K2PO4 i 0.05 % Tweem 20 podešen na pH 7.4 ).
Postupak ispiranja se ponavlja 2 X 3 minuta. Ispiranje se može obaviti i uređajem za standardizovano ispiranje ploča.
Za svaku ploču rastvoriti 1 ml MAb MAFF 26 ( A.D.S. ) sa 9 ml bloking pufera i dodati po 100 µl u svaki bunarčić. Ploče prekriti parafilmom i inkubirati 1 h na 33 ºC. Nakon toga ponoviti postupak ispiranja.
Za svaku ploču rastvoriti 2 µl IgG antirat konjugovane alkalnom fosfatazom sa 10 ml bloking pufera i po 100 µl u svaki bunarčić. Ploče prekriti parafilmom i inkubirati 1 h na 33 ºC. Nakon toga ponoviti postupak ispiranja.
Za svaku ploču rastvoriti 7.5 mg p-nitrofenilfosfataze u 10 ml 1 m dietanolamina ( pH 9.8 ). Ispipetirati po 100 µl u svaki bunarčić na ploči. Ploče pokriti i ostaviti na sobnoj temperaturi 1 h.
Zatim se vrši očitavanje rezultata ELISA testa na ELISA čitaču na 405 nm talasne dužine.
Sva merenja koja su dva i više puta veća od prosečne vrednosti negativne kontrole smatraju se pozitivnim na C.acutatum.

Dodatak – 3

PROCEDURA ZA IZOLACIJU

Izolacija se može izvršiti bilo na čistoj PDA podlozi bilo na PDA podlozi koja sadrži 60µg L -1 penicilijum G sodiju soli i 200µg L-1 streptomicin sulfata ( PDA + ) , ili na semiselektivnoj podlozi. Izbor podloga zavisi od očekivanog stepena kontaminacije drugim mikroorganizmima. Izolati treba da se inkubiraju na 25°C 12h UV / 12h mrak. Direktna izolacija je takođe moguća na podlozi MBC.

Direktna izolacija iz acervula na peteljkama ili plodovima

Prihvatljiv inokulat za izolaciju su i acervule zaraženog biljnog materijala na hranljivim podlogama. Izvršiti inkubaciju kao što je opisano i ponovo vršiti zasejavanje na odabranim podlogama kako bismo dobili čistu kulturu C.acutatum.

Izolacija ispiranjem peteljki nakon parakvat tretmana

Pojedinačne inficirane peteljke smestiti u zatvorene epruvete od 10ml sa 0,5ml sterilne,destilovane vode ( SDW ) ( ili koating puferom – videti serološku identifikaciju ) . Zatim izvršiti mućkanje na Vortex-u minimalno 10s da bi se obezbedilo da sve peteljke budu oprane.
Premestiti 10µl tečnosti u sterilnu ependorficu od 1,5ml sa 90µl sterilne destilovane vode , kako bismo dobili razređenje
1 : 10.

Ovo razređenje razrediti sterilnom destilovanom vodom da bismo dobili rastvor 1×105 i 1×104 .
Raširiti po 25µl razređenja 104 i 105 u posebne petri kutije sa PDA podlogama i inkubirati kao što je opisano. Preko dana vizuelno pregledati radi utvrđivanja prisustva kolonija C.acutatum i potvrditi njihovo prisustvo kao što je gore opisano.
Potvrđeno čistu kulturu C.acutatum ponovo zasejati na sveže napravljenu PDA podlogu.

Dodatak – 5

Procedura identifikacije PCR-om

Prozvedeno je nekoliko PCR prajmera za dijagnostikovanje C.acutatum ali je trenutno dostupan samo jedan a tehnika korišćenja još uvek nije usavršena. DNA poznatog izolata C.acutatum-a i drugih vrsta gljiva koristi se, naizmenično, kao pozitivan i negativan kontrolni materijal. Izolati se mogu nabaviti od CSL, YORK ( GB ). Kao negativna kontrola može se koristiti i TE pufer. Komercijalno dostupan kit za ekstrakciju DNA takođe može da se koristi za njenu ekstrakciju iz kultura.
Dodavanje micelija koja se testira sterilnim špricem u PCR master mix može da da tačnu PCR dijagnozu ali ukoliko se doda veća količina test micelije može da dovede do pojave netačnih rezultata.

Priprema uzoraka

U petri kutiju sa PDA podlogom zasejati test kulturu i inkubirati na 25ºC 12 h UV/ 12 h mrak u trajanju od 5 dana. Sterilnim staklenim štapićem skinuti oko 1 g test kulture. Staviti je u sterilni avan zajedno sa 100 µl 1 % Na2SO3, 1 % nerastvorljivog polivinilpolirolidon, 4 % bovin serum albumin i 1 ml ekstrakcionog pufera ( 20 mM sodium EDTA, 100 mM TRIS-HCl, podešen pH 8 sa HCl, 1 M NaCl, 2 % cetil trimetil amonijum bromid ). Izmacerirati uzorak sterilnim tučkom i sadržaj presuti u 2 ml mikrocentrifugalnu tubu. Zapečatiti tubu i dva puta je prevrnuti. Nakon toga tubu staviti u mikrotalasnu pećnicu i podesiti je na 65 ºC u trajanju od 20 minuta. Povremeno mešati uzorak prevrtanjem tube.
Tubu rashladiti postavljanjem u led 2 minuta i centrifugirati 5 minuta na 11 000 obrtaja.
Sačuvati supernatant.

Prečišćavanje DNA

Pripremiti rastvorljivu mešavinu DNA tako što se ispipetira 12 ml hladnog hloroforma -20 ºC i 0.5 ml izoamil alkohola u univerzalnu bocu. Hermetički zatvoriti bocu. Prevrnuti je nekoliko puta radi mešanja rastvora i staviti bocu u led. Ispipetirati 1 zapreminu ( 400 – 600 µl ) supernatanta i 0.8 zapremina rastvorljive miksture u mikrocentrifugalnu tubu od 2 ml. Okretanjem mešati uzorak. Centrifugirati 5 minuta na 11 000 obrtaja. Sakupiti supernatant u svežu tubu i odbaciti svežu fazu ( rastvor ). Postupak ponoviti kako bi se obezbedilo duplo prečišćavanje supernatanta.

DNA taloženje

Ispipetirati 350 – 400 µl ( 1 zapremina ) duplo prečišćenog supernatanta u svežu 2 ml mikrocentrifugalnu tubu sa 0.5 zapremina 5 M NaCl i 1.5 zapremina izopropanola . Hermetički zatvoriti tubu i zatvoriti i promešati sadržaj okretanje. U cilju taloženja DNA staviti tubu 20minuta u friz na -20ºC . Zatim fršiti centrifugiranje 5 minuta na 11 000 obrtaja . Odbaciti supernatant. Izvršiti ispiranje u 400µl 70% etanola i opet iscentrifugirati 5 minuta na 11 000 obrtaja. Ponovo se odbacuje supernatant , a vrh tube se osuši papirnim ubrusom. Tuba se ostavlja otvorena u laminarnoj komori kako bi se kuglice DNA osušile.
DNA kuglice pomešati sa 50µl TE pufera ( 10mM Tris HCL pH 8.0 , 1mM EDTA ).

PCR amplifikacija

Od PCR reakcione miksture uzeti 2×49µl za svaki uzorak :
– sterilna destilovana voda 24.75 µl
– 10 X PCR pufer sadrži 15 mM MgCl2 5.0 µl
– prajmer CaInt2 ( 5´- GGGGAAGCCTCTCGCGG – 3´ ) ( 5 µM ) 5.0 µl
– bovin serum albumin ( 10 mg/ml ) 5.0 µl
– DATP ( 10 mM ) 1.0 µl
– DGTP ( 10 mM ) 1.0 µl
– DTTP ( 10 mM ) 1.0 µl
– AmpliTaq polimeraza 5 U µl-1 0.25 µl

Postaviti reakcionu miksturu u dve odojene 200 µl reakcione tube i u svaku dodati po 1 µl ekstrakcione DNA iz uzorka.
Ponoviti sa istim reakcionim miksom, menjajući prajmer CaInt2 sa univerzalnim prajmerom ITS 1 (5´- TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3´ ).
Ova PCR reakcija biće potvrđena ukoliko replikovana DNA koja se nalazi u uzorku i služi kao kontrola ekstrakcionog procesa. Zagrevati reakcionu miksturu u termosajkleru koristeći sledeći program :
– 2 minuta na 94 ºC
– 30 obrtaja u trajanju od 30 s na 94 ºC, 30 s na 55 ºC, 30 s na 72 ºC; na kraju 10 minuta na 72 ºC

Detekcija umnoženih proizvoda

Na parčetu parafilma izmešati 10 µl svakog PCR uzorka sa 2 µl loading pufera ( 0.25 % bromofenil plavi, 0.25 % ksilen cianol FF u 30 % glicerola u vodi ). Dopuniti izmešani uzorak i 100 – 1000 bp marker u odvojene bunarčiće na 1.5 % agarozni gel pripremljen sa 1 X TBE pufer-om pH 8 ( 9 mM TRIS , 8.9 mM borna kiselina, 2.5 mM EDTA ). Propustiti struju kroz gel jačine od 80 V u trajanju od 1 h. Obojiti gel, 30 minuta, u vodeni rastvor etidium bromida ( 0.5 µg ml-1 ). Nakon toga, gel postaviti u posudu sa svežom vodom da bi se ostvario višak etidium bromida. Izvršiti pregled gela u transiluminatoru na 312 nm i sačuvati sliku.

Sanja Nikolić, stručni saradnik za zaštitu bilja
Korišćeni podaci sa EPPO sajta